روش لترال فلو (Lateral Flow)
روش لترال فلو یک پلتفرم سنجش است که برای استفاده در محل مراقبت بیمار (POC) ایده آل است. سنجش های بر پایه لترال فلو (LFAs) ابزارهای تشخیصی یکبار مصرف هستند که می توانند برای نشانگرهای زیستی در نمونه هایی از قبیل بزاق، خون، ادرار و مواد غذایی به کار روند. هر تست لترال فلو دارای اجزایی از قبیل : پد نمونه ، پد مزدوج، غشا و پد جاذب است.
پد نمونه :
نقش این پد شامل قبول نمونه، آماده سازی آن به طوری که با فرآیند تست سازگار شود و در نهایت آزادسازی مؤثر آن است. آماده سازی نمونه شامل فیلترکردن ذرات یا گلبول های قرمز خون، تغییر pH نمونه، به دام انداختن اجزای نمونه مانند میوسین است که می توانند باعث ایجاد مزاحمت در تست و مختل کردن اجزای تشکیل دهنده ماتریس شوند. انتخاب مواد برای اهداف ذکر شده، می تواند اثر زیادی روی عملکرد آزادسازی آنالیت بگذارد. آماده سازی عموماً از طریق غوطه وری و خشک کردن انجام می شود. اگر آماده سازی هایی لازم باشد روش باید به دقت طراحی شود تا از ایجاد منابع خطا مانند به وجود آمدن گرادیان غلظتی بافر و اثر لبه ای طی خشک کردن جلوگیری شود. مواد استفاده شده برای پد نمونه بستگی به نوع کاربرد و نیازمندی های آن دارد و می توان از سلولز، فیبر شیشه ای، ابریشم مصنوعی و سایر مواد فیلترکننده نام برد.
پد مزدوج :
نقش این پد در سیستم لترال فلو، پذیرفتن ترکیب مزدوج، نگهداری پایدار آن طی دوره عمر مفید کیت و آزادسازی مؤثر و تکرارپذیر آن در شروع آزمایش است. در عمل، تغییرات در قرار دادن مزدوج بر روی پد، خشک کردن و آزادشدن از پد تاثیر زیادی در ضریب تغییرات عملکرد اندازه گیری دارد. حساسیت اندازه گیری می تواند به صورت نامطلوبی از مزدوج شدن ضعیف و رهاشدن گونه مزدوج از سطح پد تأثیر بپذیرد. بسته به نوع سیستم، برخی اوقات آزادسازی سریع گونه مزدوج مورد نظر است در حالی که در بقیه موارد آزاد شدن آرام، مطلوب است هر چند آزادسازی همیشه باید ثابت باشد. به علت طبیعت موادی که استفاده می شود، اغلب لازم است به منظور حصول اطمینان از پایداری و آزادسازی بهینه گونه مزدوج، پد مزدوج، پیش آماده سازی شود. پیش آماده-سازی با غوطه ور کردن پد در محلول آبی پروتئین، سورفکتنت و پلیمرها و سپس خشک شدن انجام می شود. این مرحله شبیه غوطه ورسازی و خشک کردن است که در مورد غشاء نیتروسلولز گفته شد و می تواند به صورت دستی یا به صورت خودکار انجام شود معمولا خشک کردن پیوسته شرایط مناسبی را برای فرآیندی همگن فراهم می کند. افزایش گونه های مزدوج شده به پد پیش آماده شده، یک مرحله حساس برای عملکرد نهایی تست نواری است. دو روش به طور عمومی مورد استفاده قرار می گیرند. روش اول شامل غوطه ور کردن پد پیش آماده سازی شده به درون محلول سوسپانسیون می باشد و روش دوم، دیسپنس کردن با دیسپسنرهای کمی غیرتماسی می باشد. با توجه به سیستم مزدوج، انتخاب روش مزدوج کردن و نشانگرها مهم هستند. نشانگرهای متداول استفاده شده شامل کلوئید طلا و ذرات لاتکس یکنواخت می باشند. مواد قابل انتخاب شامل فیبرهای شیشه ای، پلی استرها و یا ابریشم مصنوعی میباشد.
غشا :
هدف ناحیه تجزیه ای (غشا) در لترال فلوایمونواسی، اتصال پروتئین در خط تست و کنترل و حفظ پایداری و واکنش پذیری آن در طول عمر محصول می باشد. زمانی که تست آغاز می شود این بخش باید نمونه و ترکیب مزدوج را از پد مزدوج دریافت کند و آنها را به طور پیوسته به منطقه واکنش هدایت کند و اجازه بدهد که واکنش در خط تست و خط کنترل اتفاق بیافتد و واکنشگر اضافی بدون اتصال از آن خارج شود. ماده ای که در قسمت عمده سیستم های لترال فلو استفاده می شود نیتروسلولز می باشد. نیتروسلولز به علت خصوصیاتی منحصر به فردی که دارد برای استفاده در سیستم های لترال فلو مفید می باشد. از جمله این خصوصیات می توان به قیمت پائین، جریان موئینگی ثابت، ظرفیت بالای اتصال پروتئین، آسانی کار کردن با آن و در دسترس بودن انواع مختلفی از محصولات با سرعت های جریان و محتوای سورفکتنت مختلف اشاره کرد. کنترل دقیق فرآیندهای کلیدی دیسپنس کردن، غوطه وری، خشک کردن و توجه به آماده سازی شیمیایی و بیولوژیکی غشاء به منظور جلوگیری از ورود متغیرهای اضافی به درون محصول نهایی برای موفقیت اجتناب ناپذیر است.
پد جاذب:
موتور آزمایش است و برای مکش همه مایعات وارد شده به تست نواری و نگهداری آنها تا انتهای آزمایش، طراحی شده است. این پد از جریان برگشتی مایعات در نوار تست جلوگیری می کند. پد جاذب عمدتا از جنس سلولزاست.
در نهایت تمام اجزا بر روی یک کارت تکیه گاه که معمولا از جنس پلی وینیل کلراید است، تثبیت می شوند. روش های لترال فلو بر اساس مکانیسم عمل به دو قالب ساندویچی و رقابتی عمل می کنند:
قالب ساندویچی:
معمولا برای تشخیص آنالیت های بزرگ که حداقل دو محل یا اپیتوپ اتصال دارند. معمولا یک آنتی بادی با نانو ذرات مزدوج شده و آنتی بادی دیگر روی خط تست قرار دارد. اگر آنالیت در نمونه حاضر باشد، به هر دو آنتی بادی ها متصل خواهد شد و پاسخ تست مثبت می شود. شدت سیگنال در خط تست در این قالب با غلظت آنالیت متناسب است.
قالب رقابتی:
این قالب برای زمانی که زوج های آنتی بادی در دسترس نیستند و یا اندازه آنالیت کوچک است و نمی تواند همزمان به چند آنتی بادی اتصال یابد، استفاده می شود. در این قالب، خط تست معمولا حاوی مولکول آنالیت است و پد مزدوج حاوی مزدوج آنتی بادی نانوذرات است. اگر آنالیت هدف در نمونه حاضر باشد، آنالیت به مزدوج متصل می شود و از اتصال آنالیت به خط تست جلوگیری می کند. اگر آنالیت هدف در نمونه وجود نداشته باشد مزدوج به آنالیت خط تست متصل می شود و منجر به تولید سیگنال می شود. در قالب رقابتی، شدت سیگنال به طور معکوس با مقدار حضور آنالیت در نمونه متناسب است.
انواع تست های لترال فلو از نظر ساختار نهایی کیت:
کیت های بر پایه لترال فلو می توانند به شکل نوار یا کاست باشند. هر دو نوع تست نواری و کاست به روش مشابهی عمل می کنند و عواملی همچون نوع نیاز صنعت و بازار و ماتریس نمونه تعیین کننده شکل نهایی محصول می باشد. تفاوت این دوساختار، نحوه اعمال نمونه بر روی پد نمونه خواهد بود به طوری که در شکل نواری از طریق غوطه وری نوار از قسمت پد نمونه، در نمونه انجام می شود. در شکل کاست، نوار تست در یک کاست کوچک قرار گرفته است، این کاست دارای دو پنجره در بخش بالایی است. یکی از پنجره ها جهت اعمال نمونه بر روی نوار تست و دیگری جهت مشاهده نتایج آزمایش در کاست تعبیه شده است و نمونه با استفاده از قطره چکان درون پنجره نمونه، اعمال می شود.
تست های لترال فلو دارای چندین مزیت نسبت به سایر فناوری های تشخیصی هستند از جمله:
• کاربری آنها بسیار ساده است، کافی است چند قطره را به قسمت اعمال نمونه بر روی نوار تست اضافه کنید و نتایج را چند دقیقه بعد با چشم مشاهده کنید.
• تست ها ارزان و کم هزینه هستند.
• کیت ها می توانند در دمای محیط نگهداری شوند و طول عمر چند ساله دارند.
• حساسیت و گزینش پذیری بالا
• نیاز به حجم کمی از نمونه برای انجام تست
• تست ها تک مرحله ای بوده و نیاز به مراحل آماده سازی ندارند
• زمان کوتاه برای مشاهده نتایج تست
• داشتن پتانسیل بالا جهت تولید انبوه و تجاری سازی
کیت های بر پایه لترال فلو برای طیف وسیعی از آنالیت های هدف وجود دارند از جمله برای نظارت بر تخمک گذاری، تشخیص بیماری های عفونی و اندازه گیری نشانگرهای زیستی انسان. همچنین محصولاتی برای کاربرد در کشاورزی، محیط زیست و امنیت مواد غذایی معرفی شده است. در حالی که تست های اولیه نتایج کیفی بر اساس وجود یا عدم وجود خط تست ارائه می دهند، تست هایی طراحی شدند که قابلیت سنجش های نیمه کمی و کمی و ادغام شده با خوانشگر های دستی پیشرفته را فراهم آورده اند. روش لترال فلو ایمونواسی با استفاده از اصطلاحات مختلف توصیف شده است، نام های رایج شامل تست لترال فلو، ابزار لترال فلو، سنجش لترال فلو، سنجش ایمونوکروماتوگرافی، تست سریع، تست نواری و .... هستند.
نانو ذرات در نقش نشانگر در لترال فلوایمونواسی :
تست های لترال فلو از ذرات به شدت رنگی یا فلورسنت تشکیل شده اند که در خط تست بر روی یک غشای نیتروسلولوزی سفید متصل شده اند و سیگنال نوری ایجاد می کنند. این سیگنال را می توان با چشم (کیفی یا نیمه کمی) یا با ابزار (کمی) خوانده شود. برای به حداکثر رساندن حساسیت دستگاه، هر اتصال باید قویترین سیگنال ممکن را تولید کند. در حالی که ذرات بزرگتر سیگنال قوی تری ایجاد می کنند و مشاهده آن آسان تر خواهد بود، ذراتی که خیلی بزرگ هستند به راحتی از طریق غشاء عبور نمی کنند و بنابراین فرصت محدودی برای اتصال به خط تست خواهند داشت. بنابراین، ذرات با اندازه های بین 20 و 500 نانومتر به طور معمول برای استفاده از روش لترال فلو انتخاب می شوند. ذرات فلورسنت نیز می توانند با همین قانون کلی به کار روند. هرچه ذرات دارای فلورسانس، اتصال قوی تر داشته باشند، سیگنال قوی تر می شود. یکی از رایج ترین ذرات نشانگر مورد استفاده در لترال فلو، نانوذرات طلا است. نانوذرات طلا خواص نوری مطلوبی دارند که آنها را به جاذب های فوق العاده قوی نور تبدیل می کند. نشانگرهای دیگر شامل ترکیبات پلی استایرن (لاتکس) رنگی، دانه های مغناطیسی ، نقاط کوانتومی هستند.